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中华人民共和国国家标准GB5521-85谷物和谷物产品α-淀粉酶活性的测定比色法
中国粮油信息网  2010-1-16 14:17:55   来源:本网论坛   【

本标准适用于商品粮食中淀粉酶活动度的测定。

1 仪器和用具

1.1 电炉;
1.2 恒温水浴锅;
1.3 温度计:100℃; 
1.4 抽气装置;
1.5 2号玻璃漏斗;
1.6 移液管:5、20ml;
1.7 容量瓶:50、100ml;
1.8 锥形瓶:100ml;
1.9 瓷蒸发皿:研钵等。

2 试剂

2.1 0.1N高锰酸钾溶液。
2.2 2%可溶性淀粉溶液。
2.3 10%氯化钡溶液。
2.4 30%硫酸钠溶液。
2.5 中性乙酸铅溶液:称取30g乙酸铅和5g氧化铅放入瓷蒸发皿内,加少量水,在电炉上加热煮沸,煮至由黄色变成紫白色为止,用190ml热水将它移入细口瓶内,置于温暖处,待澄清后进行过滤。
2.6 pH5.6磷酸盐-柠檬酸缓冲液:量取0.2M磷酸氢钠(Na2HPO4·12H2O)(分子量:358.17)溶液11.60ml和0.1M柠檬酸(C6H8O7·H2O) (分子量=210.14)溶液8.40ml混合即成。
2.7 费林氏溶液:甲液,称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)20g加水溶解至500ml;乙液,称取酒石酸钾钠100g和氢氧化钠75g加水溶解至500ml。甲、乙二液分别保存于棕色瓶中,临用时,取等量混合。如发生混浊,在混合前应进行过滤。
2.8 硫酸高铁溶液:称取硫酸铁(Fe2(SO4)3·12H2O)25g,先用300ml水溶解,加入54.35ml浓硫酸倒入500ml容量瓶中,加水到刻度。此液不得含有亚铁,检验方法是量取此液20ml,滴入1~2滴0.1N高锰酸钾溶液,如不褪色则无亚铁存在。否则应将全部溶液用高锰酸钾溶液滴定至出现淡玫瑰色为止。

3 操作方法

3.1 淀粉酶的提取:称取换算成无水的粉状试样5g,倒入100ml锥形瓶中,加水50ml(糖类和蛋白质含量多的试样,可加水100ml),摇匀,在室温下放置30min,每隔5min摇动一次,到时进行过滤。
3.2 测定α-淀粉酶活动度

3.2.1 破坏β-淀粉酶:在4个锥形瓶中各加滤液(即酶提取液)5ml,置于70℃(±0.5℃)水浴中加热15min,破坏β-淀粉酶,到时取出锥形瓶,迅速用冷水冷却,各加pH5.6缓冲液5ml,然后将4个瓶分为2个实验,2个对照。
3.2.2 实验:将2个实验瓶置于40℃水浴中预热10min,然后各加入40℃的2%可溶性淀粉溶液10ml,再在40℃水浴中准确加热15min,取出锥形瓶各注入新混合的费林氏液20ml,加热煮沸3min,然后冷却至50℃,加50℃水20ml, 静置至红色氧化亚铜沉淀。将澄清液和沉淀先后转入铺有石棉的砂芯漏斗内,用冷水洗涤沉淀至中性。将砂芯漏斗移在另一洁净抽滤瓶上,各用20ml硫酸亚铁溶液分三次溶解氧化亚铜沉淀,待沉淀全部溶解后再抽滤。各用热水15ml冲洗锥形瓶并倒入漏斗中,用冷水抽洗漏斗3~4次,至滤液遇氯化铁溶液不发生深浊为止,取下漏斗,分别用0.1N高锰酸钾溶液滴定至微红色,记下用去的0.1N高锰酸钾溶液毫升数(V1)。
3.2.3 对照:在2个对照瓶中各注入新混合的费林氏液20ml和2%可溶性淀粉溶液10ml,分别测定还原糖,记下用去的0.1N高锰酸钾溶液毫升数(V2)。

3.3 测定淀粉酶总活动度

量取提取液5ml加水至200ml,在4个锥形瓶中各注入稀释液5ml,各加水2ml和缓冲液3ml,分为2个实验和2个对照,按照测定α-淀粉酶活动度的方法中实验和对照两项操作测定还原糖。这时实验和对照用去的0.1N高锰酸钾溶液毫升数,用(V3)和(V4)表示。

4 结果计算  

淀粉酶活动度用100mg试样中的淀粉酶作用于淀粉生成麦芽糖的毫克数表示(mg麦芽糖 /100mg试样)。
α-淀粉酶活动度、淀粉酶总活动度及β-淀粉酶活动度分别按公式(1)、(2)及(3)计算:                            
α-淀粉酶活动度 = (V1 - V2) × K KMnO4 × 6 × (50/5)× (100/5000)

       = (V1 - V2) × K KMnO4 ×(6/5) ------------ (1)

淀粉酶总活动度 = (V3 - V4) × K KMnO4 × 6 ×(50/5)×(200/5)×(100/5000)
     = (V3 - V4) × K KMnO4 × 6 × 8 --------------- (2)
    β-淀粉酶活动度 = 淀粉酶总活动度-α-淀粉酶活动度 ----- (3)
式中:V1--测定α-淀粉酶活动度时实验瓶用去的0.1N高锰酸钾溶液体积,ml;
   V2--测定α-淀粉酶活动度时对照瓶用去的0.1N高锰酸钾溶液体积,ml;
   V3--测定淀粉酶总活动度实验瓶用去的0.1N高锰酸钾溶液体积,ml;
   V4--测定淀粉酶总活动度对照瓶用去的0.1N高锰酸钾溶液体,ml;
   6--经验数值,在消耗1~15ml0.1N高锰酸钾溶液的范围内,每1ml正确0.1N高锰酸钾溶液相当于6mg麦芽糖;                          
K KMnO4--高锰酸钾溶液的校正值,如0.1200N KMnO4溶液,K值为1.200 = (0.1200/0.1)                                   
V1、V2、V3、V4均为平均数。
双试验结果允许差不超过平均值的10%,取平均值为测定结果。
测定结果取小数点后 第一位。

附 录 A

降落值测定法  (补充件)

降落值是用降落仪测得的。降落值单位以仪器特制搅拌器通过固定浓度的已糊化的混合液下落一定距离所需时间(s)表示。
本法主要以α-淀粉酶对淀粉糊化作用强弱为依据,降落值小,表示α-淀粉酶活动度强
A.1 仪器和用具

降落仪由恒温水浴锅、计时器、搅拌器、试管、25ml自动加液器(或25ml移液管)、专用磨粉机、稳压器和温度计等部件组成。
安装仪器时,首先检查电源电压与仪器额定电压是否相同,然后连接水浴锅、搅拌装置和计时器。在水浴中注入水至标线,加热水温至准100℃时即可进行测定。由于大气压力的影响,水浴温度在98.0~99.8℃时,可加乙二醇或甘油调整水温至100℃。如水温超过100℃,每超过0.1℃加入0.1%异丙醇,使水浴降至100℃。
调节水浴沸点用的试剂及用量见下表:调节水浴沸点的试剂用量表

需要升高的温度

加 入 量 , % (V/V)

乙 二 醇

或 甘 油

0.2

1.9

2.5

0.4

3.9

4.9

0.6

5.8

7.4

0.8

7.8

9.8

1.0

9.7

12.3

1.2

11.3

14.2

1.4

12.9

16.1

1.6

14.4

18.1

1.8

16.0

20.0

2.0

17.6

21.9

 

A.2 磨制试样和装样

取平均样品50g以上,去杂,用降落仪磨粉机磨制后备用。小麦样品留存在筛上的麸皮不足1%时可弃去。称取相当于含水量14%的试样7g于试管内(试样含水量不是14%时,可按[7×(100-14)] /(100 -M实%)的计算公式计算实际应称取的试样克数,M实为试样实际水分百分率。

注入20±2℃水25ml,加塞后,用力垂直振动20次使试样全部悬浮于水中,去塞,插入搅拌器,并将管壁上附着物推入悬浮液中。

A.3 安装粘度计管

先把上部自动搅拌擒纵器推向右边,置粘度计管于水浴中,复原擒纵器(试样加水振动完毕至插入水浴中应在30s内完成)。

A.4 搅拌悬浮液与降落

当粘度计管插至水浴就位时,立即开动计时器,经5s后仪器即自动擒抓搅拌锤上部,开始自动搅拌(每秒两次),60s时自动释放搅拌器,使其自行降落至底部。此时,计时器自动停止,蜂音器鸣叫,以示测定完毕。

A.5 结果计算

降落值以秒表示(包括安装5s、搅拌55s和搅拌器降落所需的秒数)。
双试验结果允许差:200s以下不超过10s,201~300s不超过14s,301~400s不超过17s, 400s以上不超过20s。求其平均数,即为测定结果

附加说明:

本标准由中华人民共和国商业部提出。
本标准由商业部粮食储运局负责起草。
本标准主要起草人高修吾、杨浩然、吴艳霞、吕桂芬。
国家标准局1985-11-02发布 1986-07-01实施

(迎春)

作者:迎春    来源:本网论坛     编辑:粮信    讨论:[粮油论坛]
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